重症肌无力血清抗体的研究进展
重症肌无力（Myastheniagravis,MG）是一种累及神经肌肉接头的自身免疫性疾病，临床上表现为受累骨骼肌极易疲劳和无力，休息或使用胆碱酯酶抑制剂后可获减缓。传统的MG医治包括胆碱酯酶抑制剂（溴吡啶斯的明）、免疫抑制剂（泼尼松、硫唑嘌呤、环磷酰胺等）、丙种球蛋白、血浆交换及胸腺切除术等，从很大程度上控制了病情和减少了病人死亡率，目前文献报导仅为%。
现代免疫学研究认为，MG是一种体液免疫介导为主、细胞免疫辅助和补体参与的触及全部免疫络功能异常的自身免疫病。在体液免疫的研究中，乙酰胆碱受体抗体（AchR-Ab）是第一个被阐明的MG特异性抗体，但随后发现的其他特异性抗体和相干抗体大大丰富了MG免疫病理机制的内涵，使得MG在将来根据抗体种类进行分型成为可能，从而指点临床医治。同时，提高抗体检测方法的敏感性和特异性、使抗体检测更加方便高效也是增进其临床运用发展的重要方面。本文就MG血清抗体的作用机制、临床意义和检测方法作1综述。
1、MG自身抗体种类及主要作用机制
1、乙酰胆碱受体抗体（AchR-Ab）
MG主要累及的是散布于神经肌肉接头终板膜上的烟碱样N2型AchR受体，也称为肌肉型烟碱受体。N2型AchR由5个围绕中央孔的亚单位构成，其中包括α亚单位2个，β、δ、γ/ε亚单位各1个。在胚胎肌肉中，AchR遍及肌肉表面，随着神经开始安排肌肉，AchR逐步聚集在神经肌肉接头处，同时胚胎特异性γ亚单位被成年特异性ε亚单位所取代。如果成年时期肌肉出现去神经化，虽然AchR仍密集地散布于神经肌肉接头，AchRγ亚单位却会重新出现在肌纤维表面。
大量研究证实，AchR-Ab是有致病作用的MG抗体。AchR-Ab主要是IgG1和IgG3型抗体，而IgG1和IgG3在发挥作用的进程中会激活补体。研究表明AchR-Ab主要通过3种途径产生病理作用：首先，它可以与补体结合，构成膜攻击复合物，致使突触后膜裂解和AchR数目减少。其次，通过与AchR结合或蛋白交联作用，使AchR的内化降解增加，AchR数量减少。第三，少许但数量不等的AchR-Ab可以直接与AchR的主要免疫原区结合，从而直接阻断AchR的功能。这三种作用机制分别对应3种AchR-Ab亚型，即结合型抗体（bindingAchR-Ab）、调理型抗体（blockingAchR-Ab）、封闭型抗体（modulatingAchR-Ab），目前临床上检测的主要是结合型抗体[1]。
2、肌肉特异性酪氨酸激酶抗体（MuSK-Ab）
MuSK是一种受体酪氨酸激酶，选择性表达于神经肌肉接头突触后膜，包括一个大的细胞外功能区、一个跨膜功能区和一个细胞内激酶功能区。MuSK是聚集蛋白（Agrin）的受体之一，在神经肌肉接头发育阶段，神经末梢释放的Agrin与突触后膜的低密度脂蛋白受体相干蛋白4（LRP4）结合后激活MuSK，进而引诱AchR在突触后膜的聚集与锚定，对NMJ的构成有重要意义；在NMJ成熟以后，MuSK在保持突触后膜的稳态上也发挥重要作用[2]。
MuSK-Ab主要是IgG4型的抗体，IgG4作用进程中没有补体参与。MuSK-Ab通过结合在抗原表位，阻断MuSK与LRP4的结合，抑制Agrin-LRP4-MuSK系统功能，影响AchR的聚集，从而影响神经肌肉接头的信号传递[3]。
3、低密度脂蛋白受体相干蛋白4抗体(LRP4-Ab)
血清AchR-Ab和MuSK-Ab均阴性的MG患者称为血清双阴性MG患者（double-seronegative,dSN-MG）。2011年，Higuchi等[14]在dSN-MG患者血清中发现了低密度脂蛋白受体相干蛋白4抗体(LRP4-Ab)。LRP4是低密度脂蛋白受体（lowdensitylipoprotein-receptor,LDL-R）家族中的一员，是聚集蛋白（Agrin）的受体，与Agrin结合可以激活MuSK,进而增进突触后膜AchR的聚集[4]。LRP4-Ab主要是IgG1和IgG2抗体，由此推测其作用进程中有补体的参与。LRP4-Ab激活补体，构成免疫复合物，破坏NMJ的正常结构。同时LRP4-Ab通过干扰Agrin与LRP4的结合，阻断Agrin引诱的AchR聚集，致使肌无力的症状[14]。
4、抗聚集蛋白抗体（Agrin-Ab）
在目前的检测条件下，仍有2%-5%MG患者血清中AchR–Ab、MuSK-Ab、LRP4-Ab均为阴性[5]。2012年，Judith等[6]在3种抗体均阴性的MG患者血清中发现了抗聚集蛋白抗体（Agrin-Ab）。Agrin是一种蛋白多糖，可由运动神经末梢或肌肉分泌[5]，MG患者血清中的Agrin-Ab主要作用于神经末梢分泌的Agrin，如前文所述，Agrin-LRP4-MuSK通路可以引诱AchR在突触后膜簇集，Agrin-Ab抑制了Agrin的作用，影响AchR的簇集[7]，从而影响神经肌肉接头的信号传递。
5、横纹肌抗体
早在1960年，就有研究发现MG患者血清中存在作用于横纹肌组成成份的抗体，目前研究报导的有连接素抗体（Titin-Ab）、兰尼碱受体抗体（RyR-Ab）及其相干抗体，和其他抗肌纤维蛋白抗体。横纹肌抗体的靶蛋白多位于肌细胞内，其实不直接暴露于循环中的自身抗体，因此大多认为横纹肌抗体没有致病性[8]。
（1）连接素抗体（Titin-Ab）
Titin，又称为连接素，是一种相对分子量约的大分子蛋白，主要存在于骨骼肌及心肌纤维中，其含量在肌肉中约占10%。Titin从肌纤维Z盘逾越至M线，在保持肌纤维的完整性和弹性方面发挥重要作用，其主要免疫原区位于肌纤维A/I带交界区[9]，针对Titin产生的自身免疫反应会引发严重的肌无力症状。
（2）兰尼碱受体抗体（RyR-Ab）
RyR-Ab在MG患者中的检出率约13%–38%[10]。RyR又称为兰尼碱受体，是位于骨骼肌（RyR1）和心肌（RyR2）肌质的钙离子释放通道，在横纹肌的兴奋收缩偶联中起重要作用，RyR-Ab通过抑制RyR通道的开放和钙离子的释放影响肌肉收缩。RyR-Ab主要是IgG1和IgG3抗体，因此推测其作用进程中有补体参与。MG患者体内的RyR-Ab对位于骨骼肌和心肌的RyR存在交叉反应[8]。
（3）针对骨骼肌其它成份的抗体
与RyR1作用相干的抗体如二氢吡啶受体抗体（DHPR-Ab）[11]、瞬时受体电位通道3抗体（TRPC3-Ab）[12]，和作用于骨骼肌其他成份如肌球蛋白、原肌球蛋白、肌动蛋白、肌钙蛋白的抗体也有报导[13]，但相干研究较少，它们在MG中的作用仍需进一步研究。
6、电压门控钾离子通道抗体（Kv1.4-Ab）
Kv1.4-Ab是由Suzuki等[14]在日本MG患者的血清中发现的。Kv1.4是电压门控钾离子通道（voltage-gatedpotassiumchannel,VGKC）的一个α亚基，主要存在于脑、周围神经、骨骼肌和心肌中。MG患者血清中的Kv1.4-Ab主要作用于肌纤维表面的电压门控钾离子通道[9]，影响肌膜复极化和静息电位的保持。
2、MG自身抗体的检测方法
MG血清抗体的检测主要使用标记免疫测定技术(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)，免疫印迹法也发挥了一定作用。随着抗体测定技术的敏感性和特异性不断提高，血清抗体阴性的MG患者比例正逐渐下降。
1、AchR-Ab
目前检测血清AchR-Ab最经常使用的方法是放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitationassay,RIPA），使用等量表达胚胎型和成人型AchR的人肌细胞系TE671细胞提取物或人类截肢肌肉提取物作为抗原来源，用125I-α-BuTx标记AchR，用羊抗人IgG血清沉淀抗原抗体复合物[15]。RIPA除具有较高的灵敏度以外，还可以准确测定抗体的滴度。AchR-Ab也可以用ELISA法测定，但其灵敏度和特异度均不及RIPA，因此没有广泛使用。[15]
为了提高检测方法的灵敏度，避免放射性物资的使用，新的抗体检测方法逐步应用于AchR-Ab的检测中。细胞学检测（cellbasedassay，CBA）是更加灵敏的一种检测方法，它以活细胞而不是细胞提取物为检测对象，能更好地摹拟AchR的自然状态。Leite等[16]使用编码人类AchR的DNA转染人胚肾HEK293细胞系，使其表达完全的AchR，再用间接免疫荧光法检测抗体，在部份RIPA检测阴性的患者体内测出AchR-Ab。但这种方法目前还没法常规使用，由于培养细胞比较费时费力，而将活细胞制成商品化试剂盒仍有一定难度。
另外，荧光素酶免疫沉淀反应系统（LuciferaseImmunoprecipitationSystems,LIPS）和荧光免疫沉淀分析法（Fluorescenceimmunoprecipitationassays,FIPA）也被尝试用于AChR-Ab的检测。LIPS中将重组AChR的α亚基与海肾荧光素酶（Renillaluciferase,Ruc）融会，来检测患者血清中的AChR-Ab，但其灵敏度远低于RIPA和CBA[16]。FIPA将AChR的一个或多个亚基与绿色荧光蛋白（greenfluorescenceprotein，EGFP）融会来定量血清检测AChR-Ab，其灵敏度略低于RIPA[17]。值得一提的是，FIPA中，可以分别用绿色荧光蛋白标记AChR-Ab，用红色荧光蛋白（mCherry）标记肌肉特异性酪氨酸激酶抗体（MuSK-Ab）,再利用不同的荧光激起和发射光谱，可测定同一血清样本中的AChR-Ab和MuSK-Ab[17]。
2、MuSK-Ab
目前MuSK-Ab的检测方法中运用最广泛、灵敏度最高的方法是放射免疫沉淀法（RIPA），用125I标记的MuSK肽段做底物。但这种方法也存在一定的局限性，因常规的RIPA只检测5–20μl血清中的抗体，限制了检测的灵敏度，但增加血清的量会使免疫沉淀物的背景值太高，反而影响灵敏度。针对这1问题，Nikolaos等[18]对抗体检测方法进行了改进，建立了“两步法RIPA”。他们首先将血清中的MuSK-Ab进行分离纯化，再进行常规RIPA检测抗体滴度，结果认为这类“两步法RIPA”的灵敏度较常规方法提高了倍。另外，MuSK-Ab的细胞学检测方法也在研发中，有望作为常规方法使用[19]。
3、LRP4-Ab
LRP4-Ab目前还未在临床进行常规检测，LIPS、ELISA、CBA的检测方法都曾用于LRP4-Ab的研究中[15]，LIPS、ELISA使用兔或鼠的LRP4胞外域作抗原，CBA使用表达人类完全LRP4的HEK293细胞提供抗原，不同检测方法的抗体检出率差异较大，但由于已有的研究是在不同的人群中进行，因此没法直接比较不同检测方法的灵敏度，进一步的数据仍在研究搜集中。
4、Agrin-Ab
由于Agrin-Ab是近几年新发现的MG自身抗体，目前的研究还比较少，现有的研究多选用CBA或ELISA方法检测。
5、横纹肌抗体
横纹肌抗体目前主要使用ELISA的方法检测，Titin-Ab有商品化ELISA试剂盒，RyR-Ab的主要利用重组的RyR1的N端和C端肽段作抗原，以ELISA或免疫印迹法检测[9]。
6、Kv1.4-Ab
目前Kv1.4-Ab的主要检测方法仍是Suzuki等发现Kv1.4-Ab时所用的免疫沉淀法[14]，抗原来源为35S标记的横纹肌赘瘤细胞提取物。用重组Kv1.4蛋白做底物，以ELISA或免疫印迹法尚没法检测到Kv1.4-Ab。
3、MG自身抗体的临床意义
1、AchR-Ab
AchR-Ab在MG患者中的特异度很高，被认为是MG的诊断指标之一。在单纯眼肌型MG患者中AchR-Ab的阳性率约为50%，全身型患者中阳性率约为90%。目前认为血清AchR-Ab滴度与MG的严重程度没有直接相关性，但眼肌型MG患者与全身型MG患者相比，AchR-Ab滴度较低。对某个患者来讲，AchR-Ab水平的变化与临床病情的严重程度有一定相关性[1]。有研究指出，部份MG患者使用激素、免疫抑制剂或行胸腺切除术后，临床症状的改良伴随有AchR-Ab滴度下落。但是，抗体阳性其实不代表病情处于活动期，许多患者减缓期体内的AchR-Ab水平仍高于正常对比值。AchR-Ab阳性的患者大多对胆碱酯酶抑制剂的反应较好[1]。
2、MuSK-Ab
在AChR-Ab阴性的MG患者中，约有50%可检测到MuSK-Ab，但其检出率在不同地域的人群中差别较大，我国的MG患者MuSK-Ab的检出率较低[7]。在所有MG患者中，MuSK-Ab的检出率约为5%-8%[1]。
MuSK-Ab在MG患者中的特异性也很高，且与AchR-Ab同时阳性的病例极少。单纯眼肌型MG患者中MuSK-Ab阳性者很少。MuSK-Ab阳性的MG患者通常为早发全身型，多呈急性起病，女性多见，常迅速累及延髓肌群，呼吸衰竭发生率高，易发生危象，中轴肌肌力差，可见脸部肌肉、咀嚼肌、舌肌萎缩，重复电刺激、新斯的明实验阳性率较低，极少合并胸腺瘤或胸腺增生。这类患者临床表现不典型，诊断有一定困难。MuSK-Ab滴度与疾病的严重性密切相干，抗体滴度的变化可以反应病情的严重程度，还可以评价医治效果。在接受免疫抑制剂医治后，抗体的滴度较医治前有明显的下落，而接受胸腺切除后抗体滴度变化不大[20]。
在医治反应方面，MuSK-Ab阳性的MG患者对胆碱酯酶抑制剂的反应较差，乃至运用胆碱酯酶抑制剂后会加重病情。运用糖皮质激素可以改良患者的症状，但在激素减量的进程中患者容易出现病情反复。血浆置换、免疫抑制剂对改良患者症状作用明显。另外，运用利妥昔单抗医治对其他药物不敏感的MuSK-Ab阳性的MG患者，临床症状有改良明显。胸腺切除术对患者病情改良无明显作用[8]。所有的这些特点提示MuSK-Ab阳性MG可能是MG中一个独立的亚型。
3、LRP4-Ab
2013年，Zisimopoulou等[15]用细胞学检测的方法，利用表达人类完全LRP4的HEK293细胞，对来自10个国家和地区的800例MG患者血清进行了检测分析，得出LRP4-Ab总的检出率为18.7%，但在不同种族的人群中差异较大。健康对比组血清中LRP4-Ab均阴性，4/110例多发性硬化患者对比血清中LRP4-Ab阳性。在既往的研究中，视神经脊髓炎、Lambert-Eaton综合征患者的血清中也曾发现LRP4-Ab阳性。另外，他们还发现了LRP4-Ab和AchR-Ab同时阳性及LRP4-Ab和MuSK-Ab同时阳性的患者[4]。
与AChR-Ab或MuSK-Ab阳性的患者相比，LRP4-Ab阳性的MG患者临床症状较轻，较少产生危象，对胆碱酯酶抑制剂、激素和其他免疫抑制剂的医治反应较好[4]。
4、Agrin-Ab
在Judith等[6]使用CBA的方法研究发现Agrin-Ab在所有MG患者中的检测率约为15%（24/161），在血清阴性（AchR–Ab、MuSK-Ab、LRP4-Ab均为阴性）的MG患者中检出率也约为15%（11/73），有13例患者Agrin-Ab与AchR–Ab同时阳性。2014年，ZhangBin等[5]用ELISA的方法也在3种抗体均阴性的MG患者血清中检测出Agrin-Ab，他们的研究中Agrin-Ab在所有MG患者中的检出率约为7%—8%（7/93）,在血清阴性的患者中检出率为50%（2/4），5例患者Agrin-Ab与AchR–Ab同时阳性。
由于Agrin-Ab存在于血清抗体阴性的MG患者中，因此认为Agrin-Ab可能是一种新的有致病作用的MG自身抗体。但Agrin-Ab的致病机制、Agrin-Ab阳性MG患者的临床特点仍需进一步研究。
5、横纹肌抗体
横纹肌抗体并不是是MG特异性抗体，也存在于其他自身免疫病或伴随胸腺瘤的非MG疾病中，它们在MG中的运用主要在于MG合并胸腺瘤的诊断。
在伴随胸腺瘤的MG患者中Titin-Ab检出率约为70%-90%。Titin-Ab主要存在于AchR-Ab（+）的MG患者中，在MuSK-Ab（+）MG患者或血清抗体阴性的MG患者中还没有发现Titin-Ab[8]。这提示Titin-Ab的出现可能和AchR-Ab相干。Titin-Ab的滴度与疾病的严重程度相干，该抗体滴度的变化可以作为随访MG医治效果的指标之一。Titin-Ab阳性的患者通常呼吸肌受累较重。Titin-Ab在MG患者是不是合并胸腺瘤的诊断中具有良好的指导作用，对小于40岁的MG患者，如果Titin-Ab阳性，应怀疑合并胸腺瘤，即便胸腺CT未显示出，也不能完全除外，应进一步跟踪随访[21]。
RyR-Ab的临床意义与Titin-Ab类似，主要用于MG合并胸腺瘤的诊断。Romi等[22]通过对221例患者的回顾性研究发现，约50%合并胸腺瘤的MG患者RyR-Ab阳性。RyR-Ab阳性患者主要为晚发型MG，病情较重，起病时多先累及延髓肌、呼吸肌和颈部肌肉。抗体滴度与病情严重程度相干。RyR-Ab阳性患者多合并侵袭性或恶性胸腺瘤，因此这类患者在行胸腺切除术时应斟酌扩大切除范围[23]。
6、Kv1.4-Ab
Kv1.4-Ab在MG患者中的检出率约为%[9]。Suzuki等[14]对日本MG患者中Kv1.4-Ab阳性个体的临床特点进行了分析，发现患者以全身型MG为主，无明显性别差异，抗体阳性患者更容易产生延髓麻痹和肌无力危象，多合并胸腺瘤，易并发心肌炎、心律不齐等心脏疾病。同时，他们对3例Kv1.4-Ab阳性的MG患者进行了前瞻性研究，发现3例患者在病程中都产生了心肌炎，据此推测MG患者血清中Kv1.4-Ab可先于心脏疾病出现，因此对Kv1.4-Ab阳性的患者要特别注意其是不是合并心脏伤害，即便一次检查未发现心脏疾病也应对其心功能进行随访监测[24]。
Romi等[25]针对Kv1.4-Ab的研究发现，在白种人当中，Kv1.4-Ab阳性的MG患者主要以女性、晚发型MG为主，且症状较轻，说明Kv1.4-Ab的临床意义在不同人种当中存在差异，仍需要更多研究来进一步阐明。
上述几种主要相干血清抗体的特点、临床意义和检测方法参见表1。另外，还有其他多种抗体也被认为与MG相干。包括突触前膜受体抗体（PsM-Ab）[26]，乙酰胆碱酯酶抗体（AchE-Ab）[6]，β-肾上腺素受体抗体（βAR-Ab）[27]，抗甲状腺抗体（Thyroid-Ab）[28]，细胞因子抗体[29]等，但这些抗体在MG中的特异性较弱，且针对这些抗体的研究较少，目前在临床的运用较少，故不再逐一详述。
总之，多种MG特异性抗体和相干抗体的发现可以帮助我们更好地理解MG的病发机制，提高MG的诊断水平，指点医治方案的选择，评价医治反应及评估患者预后。同时，研发能够同时检测多种抗体的检验技术也是将来发展的重要方面，如尝试建立表达多种MG抗原的HEK293细胞，或利用生物芯片技术，从而实现在一次检测中完成对多种抗体的检查，可以大大提高抗体检测效力。
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